jueves, 3 de diciembre de 2020

Review report Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020 – CORMAN-DROSTEN REVIEW REPORT

INFORME DE REVISIÓN DE CORMAN-DROSTEN

A CARGO DE UN CONSORCIO INTERNACIONAL DE CIENTÍFICOS DE CIENCIAS SOBRE LA VIDA (ICSLS)

Informe de revisión de Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020

Este estenso informe de revisión se ha presentado oficialmente al comité editorial de Eurosurveillance el 27 de noviembre de 2020 a través de su portal de presentación, adjuntando a este informe de revisión una carta de solicitud de retractación y retirada, firmada por todos los autores principales y co-autores. El primer y último nombre de la lista son el primer y segundo autores principales. Todos los nombres intermedios son co-autores.

La revisión esterna por pares de la prueba RTPCR para la detección del SARS-CoV-2 revela 10 defectos científicos importantes a nivel molecular y metodológico: tiene como consecuencia resultados positivos falsos.

Pieter Borger(1), Bobby Rajesh Malhotra(2) , Michael Yeadon(3) , Clare Craig(4), Kevin McKernan(5) , Klaus Steger(6) , Paul McSheehy(7) , Lidiya Angelova(8), Fabio Franchi(9), Thomas Binder(10), Henrik Ullrich(11) , Makoto Ohashi(12), Stefano Scoglio(13), Marjolein Doesburg-van Kleffens(14), Dorothea Gilbert(15), Rainer Klement(16), Ruth Schruefer(17), Berber W. Pieksma(18), Jan Bonte(19), Bruno H. Dalle Carbonare(20), Kevin P. Corbett(21), Ulrike Kämmerer(22)

RESUMEN

En la publicación titulada "Detección del nuevo coronavirus de 2019 (2019-nCoV) mediante RT-PCR en tiempo real" (“Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR”, Eurosurveillance 25(8) 2020) los autores presentan un flujo de trabajo para el diagnóstico y un protocolo RT-qPCR para la detección y el diagnóstico de 2019-nCoV (ahora conocido como SARS-CoV-2), que afirman haber validado, así como una sólida metodología de diagnóstico para su uso en laboratorios de salud pública. 

A la luz de todas las consecuencias resultantes de esta misma publicación para las sociedades de todo el mundo, un grupo de investigadores independientes realizó una revisión punto por punto de la mencionada publicación en la que 1) se comprobaron de forma cruzada todos los componentes del diseño del ensayo presentado, 2) se evaluaron las recomendaciones del protocolo RT-qPCR con las buenas prácticas de laboratorio y 3) se essaminaron los parámetros en relación con la literatura científica relevante que cubre el campo. 

El protocolo RT-qPCR publicado para la detección y el diagnóstico de 2019-nCoV y el manuscrito padecen numerosos errores técnicos y científicos, entre ellos un diseño insuficiente del cebador, un protocolo RT-qPCR problemático e insuficiente y la ausencia de una validación precisa de la prueba. Ni la prueba presentada ni el propio manuscrito cumplen los requisitos para una publicación científica aceptable. Además, no se mencionan los graves conflictos de intereses de los autores. Por último, el plazo muy breve entre la presentación y la aceptación de la publicación (24 horas) significa que en este caso no se realizó un proceso sistemático de revisión por pares o que la calidad fue deficiente. Proporcionamos pruebas convincentes de varias insuficiencias, errores y fallos científicos.

Teniendo en cuenta los defectos científicos y metodológicos presentados aquí, confiamos en que el consejo editorial de Eurosurveillance no tenga otra opción que retirar la publicación.

INFORME DE REVISIÓN EN ABREVIATURA

En el presente artículo se van a mostrar numerosos y graves defectos del artículo de Corman-Drosten, cuya importancia ha llevado en todo el mundo a un diagnóstico erróneo de las infecciones atribuidas al SARS-CoV-2 asociadas a la enfermedad COVID-19. Nos enfrentamos a estrictos encierros que han destruido la vida y los medios de subsistencia de muchas personas, el acceso limitado a la educación. Estas restricciones impuestas por los gobiernos de todo el mundo son un ataque directo a los derechos básicos de las gentes y a sus libertades personales, todo ello con el resultado de daños colaterales para economías enteras a escala mundial.

Hay diez problemas gravísimos en el artículo de Corman-Drosten que esbozaremos y esplicaremos con mayor detalle en las siguientes secciones.

La primera y principal cuestión es que el nuevo coronavirus SARS-CoV-2 (en la publicación denominado 2019-nCoV y en febrero de 2020 denominado SARS-CoV-2 por un consorcio internacional de espertos en virus) se basa en secuencias in silico (teóricas), suministradas por un laboratorio de China [1], porque en ese momento no se disponía de material de control del SARS-CoV-2 infeccioso ("vivo") o inactivado, ni del ARN genómico aislado del virus. Hasta la fecha, la autoría no ha realizado ninguna validación basada en virus aislados del SARS-CoV-2 o en el ARN completo del mismo. Según Corman et al.:

"Nos propusimos desarrollar y desplegar una sólida metodología de diagnóstico para su uso en laboratorios de salud pública sin disponer de material viral." [1]

Aquí hay que poner atención en los dos objetivos declarados: a) desarrollar y b) desplegar una sólida metodología de diagnóstico para su uso en laboratorios de salud pública . Estos objetivos no pueden alcanzarse sin disponer de material viral real (por ejemplo, para determinar la carga viral infecciosa). En cualquier caso, sólo un protocolo con la mássima precisión puede ser el objetivo obligatorio y primario en cualquier escenario-resultado de esta magnitud. La determinación de la carga viral crítica es una información obligatoria, y es responsabilidad del grupo de Christian Drosten realizar estos esperimentos y proporcionar los datos cruciales.

Sin embargo, estas secuencias in silico se utilizaron para desarrollar una metodología de prueba RT-PCR para identificar el mencionado virus. Este modelo se basó en el supuesto de que el nuevo virus es muy similar al del SARS-CoV de 2003, ya que ambos son beta-coronavirus.

Por lo tanto, la prueba PCR se diseñó utilizando la secuencia genómica del SARS-CoV como material de control para el componente Sarbeco; lo sabemos por nuestra comunicación personal por correo electrónico con [2] uno de los coautores del artículo de Corman-Drosten. Este método para modelar el SARS-CoV-2 fue descrito en el artículo de Corman-Drosten de la siguiente manera:

"el establecimiento y la validación de un flujo de trabajo de diagnóstico para la detección y confirmación específica de 2019-nCoV, diseñado en ausencia de aislamientos de virus disponibles o de muestras de pacientes originales. El diseño y la validación fueron posibles gracias a la estrecha relación genética con el SARS-CoV de 2003, y con la ayuda del uso de la tecnología de ácido nucleico sintético."

La Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcripción Inversa (RT-PCR) es una importante tecnología biomolecular para detectar rápidamente fragmentos raros de ARN que se conocen de antemano. En el primer paso, las moléculas de ARN presentes en la muestra se transcriben de forma inversa para producir ADNc. A continuación, el ADNc se amplifica en la reacción en cadena de la polimerasa utilizando un par de cebadores específicos y una enzima de ADN polimerasa termoestable. La tecnología es altamente sensible y su límite de detección es teóricamente de 1 molécula de ADNc. La especificidad de la PCR está altamente influenciada por errores de diseño biomolecular.

¿Qué es importante cuando se diseña una prueba RT-PCR y la prueba cuantitativa RT-qPCR descrita en la publicación de Corman-Drosten?

1. Los cebadores y las sondas:

a) la concentración de los cebadores y las sondas debe ser de un rango óptimo (100-200 nM)
b) debe ser específico del gen objetivo que se desea amplificar
c) debe tener un porcentaje óptimo de contenido GC en relación con las bases nitrogenadas totales (mínimo 40%, máximo 60%)
d) para el diagnóstico del virus, al menos 3 pares de cebadores deben detectar 3 genes virales (preferiblemente lo más separados posible en el genoma viral)

2. La temperatura a la que todas las reacciones tienen lugar:

a) Temperatura de fusión del ADN (>92°)
b) Temperatura de amplificación del ADN (específica de TaqPol)
c) Tm; la temperatura de hibridación o alineamiento (la temperatura a la que los cebadores y las sondas alcanzan el objetivo de unión/desunión, que no debe ser superior a 2 °C por par de cebadores). Tm depende en gran medida del contenido GC de los cebadores.

3. El número de ciclos de amplificación (menos de 35; preferiblemente 25-30 ciclos);

En el caso de la detección de virus, >35 ciclos sólo detecta señales que no se correlacionan con el virus infeccioso determinado por el aislamiento en cultivo celular [revisado en 2]; si a alguien se le hace la prueba PCR y da positivo cuando se utiliza un umbral de 35 ciclos o más (como es el caso en la mayoría de los laboratorios de Europa y los EE.UU.), la probabilidad de que dicha persona esté realmente infectada es inferior al 3%, la probabilidad de que dicho resultado sea un falso positivo es del 97% [revisado en 3].

4. Validaciones biológicas moleculares; los productos de la PCR amplificada deben validarse ya sea pasándolos por un gel con una regla de ADN, o por secuenciación directa del ADN
5. Se deben especificar controles positivos y negativos para confirmar/descartar la detección de virus específicos
6. Debe estar a disposición un procedimiento estándar de operación (SOP)

El SOP especifica inequívocamente los parámetros anteriores, de modo que todos los laboratorios puedan establecer essactamente las mismas condiciones de prueba. Es esencial contar con un SOP universal validado, porque permite la comparación de datos dentro de los países y entre ellos.

PROBLEMAS MENORES DEL ARTÍCULO DE CORMAN- DROSTEN

1. En la Tabla 1 del artículo de Corman-Drosten se indican diferentes abreviaturas: "nM" se especifica, "nm" no. Más adelante, en lo que respecta a la nomenclatura correcta, nm significa "nanómetro", por lo tanto, nm debe leerse aquí como nM.

2. El consenso general es escribir secuencias genéticas siempre en la dirección 5'-3', incluyendo los cebadores inversos. Es muy inusual hacer la alineación con la escritura complementaria inversa de la secuencia de cebadores como lo hicieron los autores en la figura 2 del artículo de Corman-Drosten. Aquí, además, una base oscilante (wobble) se marca como "y" sin descripción de las bases que la Y representa.

3. Dos trampas engañosas del artículo de Corman-Drosten son que su Tabla 1 no incluye los valores Tm (valores de temperatura de hibridación), ni tampoco muestra los valores GC (número de G y C en las secuencias como valor porcentual de las bases totales).

PROBLEMAS MAYORES EN EL ARTÍCULO DE CORMAN-DROSTEN


A) ANTECEDENTES

Los autores presentan los antecedentes de su trabajo científico como: "El actual brote del nuevo coronavirus (2019-nCoV), de reciente aparición, plantea un desafío a los laboratorios de salud pública, ya que no se dispone de aislamientos del virus, mientras que cada vez hay más pruebas de que el brote está más estendido de lo que se pensaba inicialmente, y ya se está produciendo una propagación internacional a través de los viajeros".

Según la BBC News [4] y Google Statistics [5] hubo 6 muertes en todo el mundo el 21 de enero de 2020, el día en que se presentó el manuscrito. ¿Por qué los autores asumieron un reto así para los laboratorios de salud pública cuando en ese momento no había pruebas sustanciales que indicaran que el brote estaba más estendido de lo que se pensaba inicialmente?

Los autores declararon como objetivos desarrollar e implantar una metodología de diagnóstico sólida para su uso en los laboratorios de salud pública sin disponer de material viral. Además, reconocen que "el presente estudio demuestra la enorme capacidad de respuesta lograda mediante la coordinación de los laboratorios académicos y públicos en las redes de investigación nacionales y europeas".

B) MÉTODOS Y RESULTADOS

1. Diseño de los cebadores y las sondas
1a) Concentraciones erróneas de los cebadores

Normalmente se diseñan protocolos de prueba PCR fiables y precisos utilizando entre 100 nM y 200 nM por cebador [7]. En el artículo de Corman-Drosten, observamos concentraciones de cebadores inusualmente altas y variables para varios cebadores (tabla 1). Para los pares de cebadores RdRp_SARSr-F y RdRp_SARSr-R, se describen 600 nM y 800 nM, respectivamente. De manera similar, para el conjunto de cebadores N_Sarbeco_F y N_Sarbeco_R, se aconsejan 600 nM y 800 nM, respectivamente [1].

Debe quedar claro que estas concentraciones son demasiado altas para ser óptimas para las amplificaciones específicas de los genes objetivo. No existe ninguna razón específica para utilizar estas concentraciones estremadamente altas de cebadores en este protocolo. Más bien, estas concentraciones conducen a un aumento de la unión inespecífica y a la amplificación del producto de la PCR.


Tabla 1: Cebadores y sondas (adaptado del trabajo de Corman-Drosten; se destacan las concentraciones erróneas de cebadores)

1b) Secuencias no especificadas ("oscilantes" [wobble]) en cebadores y sondas

Para obtener resultados reproducibles y comparables, es esencial definir distintivamente los pares de cebadores. En el trabajo de Corman-Drosten observamos seis posiciones no especificadas, indicadas por las letras R, W, M y S (Tabla 2). La letra W significa que en esta posición puede haber una A o una T; R significa que puede haber una G o una A; M indica que la posición puede ser una A o una C; la letra S indica que puede haber una G o una C en esta posición.

Este elevado número de variantes no sólo es inusual, sino que también es muy confuso para los laboratorios. Estas seis posiciones no especificadas podrían dar lugar fácilmente al diseño de varias secuencias de cebadores alternativos diferentes que no se relacionan con el SARS-CoV-2 (2 cebadores RdRp_SARSr_F distintos + 8 sondas RdRp_SARS_P1 distintas + 4 RdRp_SARSr_R distintas). Las variaciones de diseño conducirán inevitablemente a resultados que ni siquiera están relacionados con el SARS CoV-2. Por lo tanto, la confusa descripción inespecífica del artículo de Corman-Drosten no es adecuada como protocolo estándar de operación. Estas posiciones no especificadas deberían haber sido diseñadas de manera inequívoca.

Estas secuencias oscilantes (wobble) ya se han convertido en una fuente de preocupación entre los especialistas, y han dado lugar a una carta al editor, escrita por Pillonel y otros [8], relativa a los errores flagrantes en las secuencias descritas. Estos errores son evidentes también en el suplemento de Corman et al.


Tabla 2: Primers y sondas (adaptado del artículo de Corman-Drosten; se resaltan los nucleótidos no especificados ("oscilantes" ["Wobbly"]) en los cebadores)

El protocolo de la OMS (figura 1), que se deriva directamente del artículo de Corman-Drosten, llega a la conclusión de que para confirmar la presencia del SARS-CoV-2 es necesario identificar en el ensayo dos genes de control (los genes E y RdRp). Cabe señalar que el gen RdRp tiene una posición incierta (oscilante [wobbly]) en el cebador directo (R=G/A), dos posiciones inciertas en el cebador inverso (R=G/A; S=G/C) y tres posiciones inciertas en la sonda RdRp (W=A/T; R=G/A; M=A/C). Así que, dos diferentes cebadores directos, cuatro diferentes cebadores inversos, y ocho diferentes sondas pueden ser sintetizados para el gen RdRp. ¡En total hay 64 combinaciones posibles de cebadores y sondas!

El artículo de Corman-Drosten habla además de un tercer gen que, de acuerdo con el protocolo de la OMS, no se ha seguido validando y se ha considerado innecesario:

"Cabe destacar que el ensayo del gen N también funcionó bien, pero no se sometió a una validación intensiva posterior porque era ligeramente menos sensible".

Esta fue una omisión desafortunada, ya que lo mejor sería utilizar los tres genes PCR como ensayos de confirmación, lo que habría dado lugar a un protocolo casi suficiente de herramientas de diagnóstico de detección de virus ARN. Los tres pasos del ensayo de confirmación minimizarían al menos los errores e incertidumbres en cada paso del proceso en relación con las posiciones oscilantes ("wobbly"). (No obstante, el protocolo no llegaría a ser una "buena práctica de laboratorio", si se tienen en cuenta todos los demás errores de diseño).

En la actualidad, lamentablemente, el ensayo del gen N no se propone en la recomendación de la OMS (figura 1) como tercer paso de confirmación obligatorio y crucial, ni se destaca en el artículo de Corman-Drosten como importante garantía opcional "para un flujo de trabajo rutinario" (Tabla 2).

Por consiguiente, en casi todos los procedimientos de prueba en todo el mundo, sólo se utilizaron 2 correspondencias de cebadores en lugar de las tres. Este descuido hace que todo el protocolo de pruebas sea inútil para obtener resultados precisos y de verdadera importancia en una pandemia en curso.

Figura 1: El ensayo confirmatorio del gen N no se resalta como tercer paso necesario en la recomendación del protocolo oficial Drosten-Corman de la OMS que se ve abajo[8] ni se requiere como paso crucial para una mayor precisión de las pruebas en la publicación de Eurosurveillance.

1c) Contenido GC erróneo (discutido en 2c, junto con la temperatura de hibridación (Tm))
1d) Detección de genes víricos

La RT-PCR no se recomienda para el diagnóstico primario de infecciones. Por ello, la prueba RT-PCR utilizada en la rutina clínica para la detección de COVID-19 no está indicada para el diagnóstico de COVID-19 sobre una base regulatoria.

"Los médicos deben reconocer la mayor precisión y rapidez de las técnicas de diagnóstico molecular para el diagnóstico de infecciones, pero también deben comprender sus limitaciones. Los resultados de laboratorio deben interpretarse siempre en el contesto de la presentación clínica del paciente, y para que los resultados de las pruebas sean fiables se requiere un lugar, una calidad y un momento de recogida de muestras apropiados". [9]

Sin embargo, puede utilizarse para ayudar al médico a realizar un diagnóstico diferencial cuando tiene que discriminar entre diferentes infecciones del pulmón (la gripe, el Covid-19 y el SARS tienen síntomas muy similares). Para confirmar el diagnóstico de un virus específico, se deben aplicar al menos 3 pares de cebadores específicos para detectar 3 genes específicos del virus. Preferiblemente, estos genes objetivo deben estar localizados a la mayor distancia posible en el genoma viral (incluyendo los estremos opuestos).

Aunque el artículo de Corman-Drosten describe 3 cebadores, estos cebadores sólo cubren aproximadamente la mitad del genoma del virus. Este es otro factor que disminuye la especificidad para la detección del virus ARN del COVID-19 intacto y aumenta la cifra de falsos positivos en los resultados de las pruebas.

Por lo tanto, aunque obtengamos tres señales positivas (es decir, los tres pares de cebadores dan 3 productos de amplificación diferentes) en una muestra, esto no prueba la presencia de un virus. Un mejor diseño de cebadores tendría cebadores terminales en ambos estremos del genoma viral. Esto se debe a que se cubriría todo el genoma viral, y tres señales positivas pueden discriminar mejor entre un virus completo (y por lo tanto potencialmente infeccioso) y genomas virales fragmentados (sin potencia infecciosa). Para poder inferir cualquier cosa de importancia sobre la infecciosidad del virus, se debería haber incluido como objetivo el gen Orf1, que codifica la enzima esencial de la replicasa de los virus del SARS-CoV (figura 2). La ubicación de los objetivos en la región del genoma viral que se transcribe con mayor intensidad y variabilidad es otra debilidad del protocolo.

Kim et al. demuestran una espresión altamente variable de 3' de ARN subgenómico en Sars-CoV-2 [23]. Estos ARNs se usan activamente como signo para pacientes asintomáticos y no infecciosos [10]. Es muy cuestionable essaminar una población de personas asintomáticas con cebadores de qPCR que tienen 6 pares de base primer-dimer en el estremo-de-cebador 3 de un cebador (figura 3).

Al parecer, la OMS recomienda estos cebadores. Probamos todos los los derivados oscilantes ("wobbly") del artículo de Corman-Drosten con la herramienta web de Thermofisher para primer dimer [11]. El cebador directo RdRp tiene una homología de 6bp 3prime con Sarbeco E Reverse. A altas concentraciones del cebador esto ya es suficiente para crear inessactitudes.

Nota: Hay una coincidencia perfecta de uno de los cebadores-N con un patógeno clínico (Pantoea), que se encuentra en pacientes inmunocomprometidos. El cebador inverso también afecta a la Pantoea, pero no en la misma región (Figura 3).

Estos son graves errores de diseño, ya que la prueba no puede discriminar entre el virus completo y los fragmentos virales. La prueba no se puede usar como un diagnóstico para los virus del SARS.

Figura 2: Posiciones relativas de los amplicones objetivo en el coronavirus del SARS y el nuevo genoma del coronavirus del 2019. ORF: marco de lectura abierto; RdRp: ARN polimerasa dependiente de ARN. Los números por debajo del amplicón son las posiciones del genoma según el SARS-CoV, NC_004718 [1];

Figura 3: Una prueba con la herramienta web de primer dimer de Thermofischer revela que el cebador directo RdRp tiene una homología de 6bp 3`prime con Sarbeco E Reverso (cuadro izquierdo). Otra prueba revela que hay una coincidencia perfecta de uno de los cebadores-N con un patógeno clínico (Pantoea) que se encuentra en pacientes inmunocomprometidos (cuadro derecho).

2. Temperatures de reacción
2a) Temperatura de fusión del ADN (>92°).

Tratada adecuadamente en el artículo de Corman-Drosten.

2b) Temperatura de amplificación del ADN.

Tratada adecuadamente en el artículo de Corman-Drosten.

2c) Contenido GC y Tm erróneos

La temperatura de hibridación determina a qué temperatura el cebador se adhiere/desprende de la secuencia diana. Para una amplificación eficiente y específica, el contenido GC de los cebadores debe alcanzar un mínimo de 40% y un máximo de 60% de amplificación. Como se indica en la tabla 3, tres de los cebadores descritos en el artículo de Corman-Drosten no están dentro del rango normal para el contenido GC. Dos cebadores (RdRp_SARSr_F y RdRp_SARSr_R) tienen valores GC inusuales y muy bajos de 28% a 31% para todas las variantes posibles de bases oscilantes, mientras que el cebador E_Sarbeco_F tiene un valor GC de 34,6% (Tabla 3 y segundo panel de la Tabla 3).

Cabe señalar que el contenido GC determina en gran medida la unión con su diana específica debido a sus tres enlaces de hidrógeno en el emparejamiento de bases. Así pues, cuanto más bajo es el contenido GC del cebador, más baja es su capacidad de unión a su secuencia de genes objetivo específica (es decir, el gen que se va a detectar). Esto significa que para que se reconozca una secuencia diana tenemos que elegir una temperatura lo más cercana posible a la temperatura real de hibridación (valor de práctica óptima) para que el cebador no se desprenda de nuevo, al tiempo que se selecciona específicamente la secuencia diana.

Si el valor Tm es muy bajo, como se observa en todas las variantes oscilantes ("wobbly") de los cebadores inversos RdRp, los cebadores pueden unirse de manera no específica a varios objetivos, disminuyendo la especificidad y aumentando los posibles resultados falsos positivos.

La temperatura de hibridación (Tm) es un factor crucial para la determinación de la especificidad/essactitud del procedimiento de qPCR y esencial para evaluar la exactitud de los protocolos de qPCR. Recomendación de mejores prácticas: Ambos cebadores (directo e inverso) deben tener un valor casi similar, preferiblemente el mismo valor.

Utilizamos el software de diseño de cebadores de libre acceso Primer-BLAST [12, 25] para evaluar los valores de las mejores prácticas para todos los cebadores utilizados en el trabajo de Corman-Drosten (Tabla 3). Intentamos encontrar un valor Tm de 60° C, mientras que de manera similar buscamos el mayor valor posible de GC% para todos los cebadores. Se consideró aceptable una diferencia máxima de Tm de 2° C en los pares de cebadores. Probando los pares de cebadores especificados en el artículo de Corman-Drosten, observamos una diferencia de 10° C con respecto a la temperatura de hibridación Tm para el par de cebadores1 (RdRp_SARSr_F y RdRp_SARSr_R). Éste es un error muy grave y hace que el protocolo sea inútil como herramienta específica de diagnóstico.

Pruebas adicionales demostraron que sólo el par de cebadores diseñados para amplificar el gen N (N_Sarbeco_F y N_Sarbeco_R) alcanzó el nivel adecuado para funcionar en una prueba de diagnóstico, ya que tiene un contenido suficiente de GC y la diferencia de Tm entre los cebadores (N_Sarbeco_F y N_Sarbeco_R) es de 1,85° C (por debajo del mássimo crucial de 2° C de diferencia). Es importante señalar que este es el gen que no fue probado en las muestras de virus (Tabla 2) ni destacado como prueba de confirmación. Además de las temperaturas de fusión muy variables y las secuencias degeneradas de estos cebadores, hay otro factor que influye en la especificidad del procedimiento: los dNTP (0,4uM) son 2 veces más altos que los recomendados para una amplificación muy específica. También se añade sulfato de magnesio a la reacción. Este procedimiento combinado con una baja temperatura de hibridación puede crear amplificaciones no específicas. Cuando se requiere magnesio adicional para la qPCR, la especificidad del ensayo debe ser essaminada más a fondo.

Los errores de diseño descritos aquí son tan graves que es muy improbable que se produzca una amplificación específica del material genético del SARS-CoV-2 utilizando el protocolo del artículo de Corman-Drosten.

Tabla 3: Contenido GC de los cebadores y sondas (adaptado del artículo de Corman-Drosten); se destacan las aberraciones de los contenidos de GC optimizados. El segundo panel muestra una tabla con los valores de las mejores prácticas de todos los cebadores y sondas utilizados en el artículo de Corman-Drosten por la Prof. Dra. Ulrike Kämmerer y su equipo.




3. El número de ciclos de amplificación

Cabe señalar que en ninguna parte del artículo de Corman-Drosten se menciona que una prueba sea positiva o negativa, ni tampoco lo que define un resultado positivo o negativo. Estos tipos de pruebas de diagnóstico virológico deben basarse en un SOP, que incluye un número validado y fijo de ciclos de PCR (valor Ct) después de los cuales una muestra se considera positiva o negativa. El máximo valor Ct razonablemente fiable es de 30 ciclos. Por encima de un Ct de 35 ciclos, se debe esperar un número rápidamente creciente de falsos positivos.

Los datos de PCR evaluados como positivos después de un valor de Ct de 35 ciclos no tienen ninguna fiabilidad.

Citando a Jaafar et al. 2020 [3]: "A Ct = 35, el valor que usamos para reportar un resultado positivo para la PCR, <3% de los cultivos son positivos." En otras palabras, no se logró aislar con éssito el virus del SARS-CoV-2 con esos altos valores de Ct.

Además, los estudios científicos demuestran que sólo se detectan virus no infecciosos (muertos) con valores de Ct de 35 [22].

Entre 30 y 35 hay una zona gris, en la que no se puede establecer con certeza un resultado positivo. Esta zona debe ser escluida. Por supuesto, se podrían realizar 45 ciclos de PCR, como se recomienda en el protocolo Corman-Drosten de la OMS (Figura 4), pero también hay que definir un valor Ct razonable (que no debe superar los 30). Pero un resultado analítico con un valor Ct de 45 no tiene absolutamente ningún sentido desde el punto de vista científico y de diagnóstico (un valor Ct razonable no debe esceder de 30). Todo esto debe ser dicho muy claramente. Es un error significativo que el artículo de Corman-Drosten no mencione el valor máximo de Ct al que una muestra puede considerarse inequívocamente como un resultado de prueba positivo o negativo. Este importante límite de umbral de de ciclos tampoco se especifica en ninguna de las comunicaciones de seguimiento presentadas hasta la fecha.

Figura 4: Recomendación del kit de RT-PCR en el protocolo oficial de la OMS de Corman-Drosten [8]. Sólo se puede encontrar un valor de ciclos (Cycler) sin el correspondiente y científicamente razonable Ct (valor de corte). Este o cualquier otro valor de ciclo no se encuentra en ningún lugar del artículo de Corman-Drosten.

4. Validaciones biomoleculares

Para determinar si los productos amplificados son realmente genes del SARS-CoV-2, es esencial la validación biomolecular de los productos de la PCR amplificada. Para una prueba de diagnóstico, esta validación es una necesidad absoluta.

La validación de los productos de la PCR debe realizarse ya sea haciendo correr el producto de la PCR en un gel de agaro-EtBr al 1% junto con un indicador de tamaño (regla o escalera de ADN) para poder estimar el tamaño del producto. El tamaño debe corresponder al tamaño calculado del producto de amplificación. O aún mejor secuenciar el producto de la amplificación. Esto último dará un 100% de certeza sobre la identidad del producto de la amplificación. Sin validación molecular no se puede estar seguro de la identidad de los productos de la PCR amplificada. Considerando los graves errores de diseño descritos anteriormente, los productos de la PCR amplificada pueden ser cualquier cosa.

Tampoco se menciona en el artículo de Corman-Drosten el caso de pequeños fragmentos de qPCR (alrededor de 100 bp): Podría ser un gel de agarosa al 1,5% o incluso un gel de acrilamida.

El hecho de que estos productos de la PCR no hayan sido validados a nivel molecular es otro error llamativo del protocolo, que hace que cualquier prueba basada en él sea inútil como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus del SARS-CoV-2.

5. Controles positivos y negativos para confirmar/rebatir la detección de virus específicos.

La suposición no confirmada que se describe en el artículo de Corman-Drosten es que el SARS-CoV-2 es el único virus del grupo beta-coronavirus similar al SARS que actualmente causa infecciones en los seres humanos. Las secuencias en las que se basa su método de PCR son secuencias in silico suministradas por un laboratorio de China [23], porque en el momento del desarrollo de la prueba de PCR no se disponía de ningún material de control del SARS-CoV-2 infeccioso ("vivo") o inactivado para los autores. Por consiguiente, la prueba de PCR se diseñó utilizando la secuencia del conocido SARS-CoV como material de control para el componente Sarbeco (Dr. Meijer, coautor del artículo de Corman-Drosten en un intercambio de correo electrónico con el Dr. Peter Borger) [2].

Se supone que todos los individuos que dan positivo en la prueba RT-PCR, como se describe en el artículo de Corman-Drosten, dan positivo en las infecciones de SARS-CoV-2. Hay tres defectos graves en su suposición. En primer lugar, una prueba positiva para las moléculas de ARN descritas en el artículo de Corman-Drosten no puede equipararse a una "infección por un virus". Una prueba RT-PCR positiva sólo indica la presencia de moléculas de ARN virales. Como se demuestra en el punto 1d (supra), la prueba Corman-Drosten no se ha diseñado para detectar el virus completo, sino sólo un fragmento del mismo. Ya hemos concluido que esto clasifica la prueba como inadecuada como prueba de diagnóstico para las infecciones del virus del SARS.

En segundo lugar, y de gran relevancia, la funcionalidad de la prueba RT-PCR publicada no se demostró con el uso de un control positivo (ARN aislado del SARS-CoV-2) que es un estándar de oro científico esencial.

En tercer lugar, el artículo de Corman-Drosten dice:

"Para demostrar que los ensayos pueden detectar otros virus relacionados con el SARS asociados a los murciélagos, utilizamos el ensayo del gen E para analizar seis muestras fecales derivadas de murciélagos disponibles de Drexler et al. [...] y Muth et al. [...]. Estas muestras positivas para el virus procedían de murciélagos rinófilos europeos. La detección de estos valores atípicos filogenéticos dentro del grupo de CoV relacionados con el SARS sugiere que es probable que se detecten todos los virus asiáticos. Esto garantizaría, en teoría, una amplia sensibilidad incluso en caso de múltiples adquisiciones independientes de variantes de virus de un reservorio animal".

Esta afirmación demuestra que el gen E utilizado en la prueba de RT-PCR, como se describe en el artículo de Corman-Drosten, no es específico del SARS-CoV-2.

Los cebadores del gen E también detectan un amplio espectro de otros virus del SARS. El genoma del coronavirus es el más grande de todos los virus ARN que infectan a los humanos y todos tienen una estructura molecular muy similar. Aún así, el SARS-CoV-1 y el SARS-CoV-2 tienen dos huellas genéticas muy específicas que los diferencian de los otros coronavirus. Primero, una secuencia única de huellas dactilares (KTFPPTEPKKDKKK) está presente en la proteína N del SARS-CoV y el SARS-CoV-2 [13,14,15]. En segundo lugar, tanto el SARS-CoV1 como el SARS-CoV2 no contienen la proteína HE, mientras que todos los demás coronavirus poseen este gen [13, 14]. Así pues, para detectar específicamente un producto de PCR del SARS-CoV1 y el SARS-CoV-2, se debería haber elegido la región anterior del gen N como objetivo de amplificación. Una prueba de diagnóstico fiable debería centrarse en esta región específica del gen N como prueba de confirmación. La PCR para este gen N no fue validada ni recomendada como gen de prueba por el artículo de Drosten-Corman, por ser "no tan sensible" con la sonda original del SARS-CoV [1].

Además, la ausencia del gen HE tanto en el SARS-CoV1 como en el SARS-CoV-2 hace que este gen sea el control negativo ideal para escluir otros coronavirus. El artículo de Corman-Drosten no contiene este control negativo, ni tampoco ningún otro control negativo. Por consiguiente, la prueba de PCR del artículo de Corman-Drosten no contiene ni un único control positivo ni un control negativo para escluir la presencia de otros coronavirus. Este es otro gran defecto de diseño que clasifica la prueba como inadecuada para el diagnóstico.

6. No se dispone de un procedimiento operativo estándar (SOP)

Debería haber un procedimiento de operación estándar ( SOP ) disponible, que especifique inequívocamente los parámetros anteriores, de manera que todos los laboratorios puedan establecer unas condiciones de ensayo idénticas. Disponer de un SOP universal validado es esencial, porque facilita la comparación de datos dentro de los países y entre ellos. Es muy importante especificar todos los parámetros de los cebadores de manera inequívoca. Observamos que esto no se ha hecho. Además, no se especifica el valor Ct para indicar cuándo una muestra debe considerarse positiva o negativa. Tampoco se especifica cuándo se considera que una muestra está infectada por el virus del SARS-CoV. Como se ha indicado anteriormente, la prueba no puede discernir entre el virus y los fragmentos de virus, por lo que el valor Ct que indica la positividad es de crucial importancia. Este valor Ct debería haberse especificado en el procedimiento de operación estándar ( SOP ) y ponerse en línea para que todos los laboratorios que realicen esta prueba tengan essactamente las mismas condiciones de límites. Que ese SOP no essita, es indicio de una ciencia errónea. Por esto los laboratorios son libres de realizar el ensayo como consideren apropiado, lo que da lugar a una enorme cantidad de diferencias. A los laboratorios de toda Europa les quedan multitud de preguntas: ¿qué cebadores pedir? ¿qué nucleótidos rellenar en los lugares no definidos? ¿qué valor Tm elegir? ¿cuántos ciclos de PCR hay que ejecutar? ¿A qué valor Ct es positiva la muestra? ¿Y cuándo es negativa? ¿Y cuántos genes probar? ¿Deberían probarse todos los genes, o sólo el gen E y RpRd como se muestra en la Tabla 2 del artículo de Corman-Drosten? ¿Debería probarse también el gen N? ¿Y cuál es su control negativo? ¿Cuál es su control positivo?

El protocolo, tal como se describe, es lamentablemente muy vago y erróneo en su diseño, de forma que uno puede ir en docenas de direcciones diferentes. No parece haber ninguna estandarización ni un SOP, por lo que no está claro cómo se puede ejecutar esta prueba.

7. Consecuencias de los errores descritos en 1-5: resultados falsos positivos.

La prueba de RT-PCR descrita en el artículo de Corman-Drosten contiene tantos errores de diseño de biología molecular (véase 1-5) que no es posible obtener resultados inequívocos. Es inevitable que esta prueba genere un enorme número de los llamados "falsos positivos". La definición de los falsos positivos es una muestra negativa, que inicialmente da un resultado positivo, pero que es negativa después de volver a hacer la prueba con la misma prueba. Los falsos positivos son resultados positivos erróneos, es decir, muestras negativas que dan positivo. Y esto es, en efecto, lo que se encuentra en el artículo de Corman-Drosten. En la página 6 del PDF del manuscrito los autores demuestran, que incluso bajo condiciones de laboratorio bien controladas, un porcentaje considerable de falsos positivos se genera con esta prueba:

"En cuatro reacciones de prueba individuales, se observó una débil reactividad inicial, sin embargo, fueron negativas al volver a probar con el mismo ensayo. Estas señales no estaban asociadas a ningún virus en particular, y para cada virus con el que se produjo una reactividad inicial positiva, había otras muestras que contenían el mismo virus en una concentración más alta pero que no dieron positivo. Dados los resultados de la amplia calificación técnica descrita anteriormente, se llegó a la conclusión de que esta reactividad inicial no se debía a la inestabilidad química de las sondas de PCR en tiempo real y sí más probablemente a los problemas de manejo causados por la rápida introducción de nuevas pruebas de diagnóstico y controles durante este estudio de evaluación". [1]

La primera frase de este estracto es una prueba clara de que la prueba PCR descrita en el artículo de Corman-Drosten genera falsos positivos. Incluso en las condiciones bien controladas del moderno laboratorio de Charité, 4 de las 310 pruebas primarias son falsos positivos por definición. Cuatro muestras negativas resultaron inicialmente positivas, y luego fueron negativas al volver a hacer las pruebas. Este es el ejemplo clásico de un falso positivo. En este caso los autores no los identifican como falsos positivos, lo que es intelectualmente deshonesto.

Otra observación reveladora en el estracto anterior es que los autores esplican los falsos positivos como "problemas de manejo causados por la rápida introducción de nuevas pruebas de diagnóstico". Imagínese los laboratorios que tienen que introducir la prueba sin toda la información necesaria que normalmente se describe en un SOP.

8. El artículo de Corman-Drosten no tuvo una revisión por pares

Antes de la publicación formal en una revista académica, los artículos científicos y médicos son tradicionalmente certificados por "revisión por pares". En este proceso, los editores de la revista reciben el asesoramiento de diversos espertos ("árbitros") que han evaluado el artículo y pueden identificar las deficiencias en sus supuestos, métodos y conclusiones. Por lo general, una revista sólo publicará un artículo una vez que los directores estén convencidos de que los autores han enfrentado los problemas que hayan visto los árbitros y de que los datos presentados apoyan las conclusiones estraídas en el artículo". Este proceso está bien descrito para la Eurosurveillance [16].

El artículo de Corman-Drosten se presentó a Eurosurveillance el 21 de enero de 2020 y se aceptó para su publicación el 22 de enero de 2020. El 23 de enero de 2020 el artículo estaba en línea. El 13 de enero de 2020 se publicó la versión 1-0 del protocolo en el sitio web oficial de la OMS [17], que se actualizó el 17 de enero de 2020 como versión del artículo 2-1 [18], incluso antes de que el artículo de Corman-Drosten se publicara el 23 de enero en Eurosurveillance.

Normalmente, la revisión por pares es un proceso que lleva mucho tiempo, ya que al menos dos espertos en la materia tienen que leer y comentar críticamente el artículo presentado. En nuestra opinión, este artículo no fue revisado por pares. Veinticuatro horas simplemente no son suficientes para llevar a cabo una revisión exhaustiva por pares. Nuestra conclusión se ve respaldada por el hecho de que hemos encontrado un enorme número de defectos de diseño gravísimos que hacen que la prueba PCR sea completamente inadecuada como herramienta de diagnóstico para identificar el virus del SARS-CoV-2. Cualquier biólogo molecular familiarizado con el diseño de la RT-PCR habría observado fácilmente los graves errores presentes en el artículo de Corman-Drosten antes del proceso de revisión propiamente dicho. El 26 de octubre de 2020 pedimos a Eurosurveillance que nos enviara una copia del informe de revisión por pares. Hasta la fecha, no hemos recibido este informe y en una carta de fecha 18 de noviembre de 2020 el ECDC, como anfitrión de Eurosurveillance, se negó a facilitar el acceso sin proporcionar razones científicas sustanciales para su decisión. Por el contrario, escriben que "la divulgación socavaría el propósito de las investigaciones científicas". [24].

9. Autores que son también editores

Un último punto es uno de los principales problemas. Resulta que dos autores del artículo de Corman-Drosten, Christian Drosten y Chantal Reusken, son también miembros del consejo editorial de esta revista [19]. Por lo tanto, hay un grave conflicto de intereses que refuerza las sospechas de que el artículo no fue revisado por pares. Parece que la rápida publicación fue posible simplemente porque los autores también formaban parte del consejo editorial de Eurosurveillance. Esta práctica se clasifica como comprometedora de la integridad científica.

CATÁLOGO RESUMIDO DE LOS ERRORES ENCONTRADOS EN EL ARTÍCULO

El artículo de Corman-Drosten contiene los siguientes errores específicos:

1. No existe ninguna razón específica para utilizar estas concentraciones extremadamente altas de cebadores en este protocolo. Las concentraciones descritas dan lugar a un aumento de los enlaces inespecíficos y a amplificaciones del producto de la PCR, lo que hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus del SARS-CoV-2.

2. La confusa descripción inespecífica que figura en el artículo de Corman-Drosten no es adecuada como protocolo de operación estándar, lo que hace que la prueba no sea apropiada como instrumento específico de diagnóstico para identificar el virus del SARS-CoV-2.

3. La prueba no puede discriminar entre el virus completo y los fragmentos virales. Por lo tanto, la prueba no puede utilizarse como diagnóstico de virus intactos (infecciosos), lo que hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus del SARS-CoV-2 y hacer inferencias sobre la presencia de una infección.

4. Una diferencia de 10° C con respecto a la temperatura de recocido Tm para el par de cebadores1 (RdRp_SARSr_F y RdRp_SARSr_R) también hace que la prueba no sea adecuada como instrumento de diagnóstico específico para identificar el virus del SARS-CoV-2.

5. Un error grave es la omisión de un valor de Ct en el que una muestra se considera positiva y negativa. Este valor Ct tampoco se encuentra en las presentaciones de seguimiento, lo que hace que la prueba no sea adecuada como instrumento específico de diagnóstico para identificar el virus del SRAS-CoV-2.

6. Los productos de la PCR no han sido validados a nivel molecular. Este hecho hace que el protocolo sea inútil como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus del SARS-CoV-2.

7. La prueba de PCR no contiene ni un control positivo único para evaluar su especificidad para el SARS-CoV-2 ni un control negativo para escluir la presencia de otros coronavirus, lo que hace que la prueba sea inútil como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus del SARS-CoV-2.

8. El diseño de la prueba en el artículo de Corman-Drosten es tan vago y defectuoso que se puede ir en docenas de direcciones diferentes; nada está estandarizado y no hay ningún procedimiento operativo estándar. Esto cuestiona enormemente la validez científica de la prueba y la hace inadecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus del SARS-CoV-2.

9. Lo más probable es que el artículo de Corman-Drosten no haya sido revisado por pares, lo que hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus del SARS-CoV-2.

10. Encontramos graves conflictos de intereses para al menos cuatro autores, además del hecho de que dos de los autores del artículo de Corman-Drosten (Christian Drosten y Chantal Reusken) son miembros del consejo editorial de Eurosurveillance. El 29 de julio de 2020 se añadió un conflicto de intereses (Olfert Landt es el director general de TIB-Molbiol; Marco Kaiser es investigador principal de GenExpress y sirve como asesor científico de TIB-Molbiol), que no se declaró en la versión original (y que sigue faltando en la versión de PubMed); TIB-Molbiol es la compañía que fue "la primera" en producir kits de PCR (Light Mix) basados en el protocolo publicado en el manuscrito de Corman-Drosten, y según sus propias palabras, distribuyeron estos kits de prueba de PCR antes de que la publicación fuera siquiera presentada [20]; además, Victor Corman & Christian Drosten no mencionaron su segunda afiliación: el laboratorio comercial de pruebas "Labor Berlin". Ambos son responsables del diagnóstico del virus allí [21] y la compañía opera en el ámbito de las pruebas de PCR en tiempo real.

A la luz de nuestro re-essamen del protocolo de prueba para identificar el SARS-CoV-2 descrito en el artículo de Corman-Drosten, hemos identificado errores y falacias inherentes que hacen inútil la prueba de PCR del SARS-CoV-2.

CONCLUSIÓN

La decisión de qué protocolos de prueba se publican y se ponen a disposición del público está en manos de Eurosurveillance. La decisión de reconocer los errores aparentes en el artículo de Corman-Drosten tiene el beneficio de minimizar enormemente el coste humano y el sufrimiento en el futuro.

¿No es en el mejor interés de Eurosurveillance retractarse y retirar este artículo? Nuestra conclusión es clara. Frente a todos los tremendos defectos y errores de diseño del protocolo PCR descritos aquí, concluimos: No queda mucha elección en el marco de la integridad y responsabilidad científica.

REFERENCIAS

[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[2] Email communication between Dr. Peter Borger & Dr. Adam Meijer: Supplementary Material

[3] Jafaar et al., Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction–Positives Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603

[4] BBC, January 21st 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836;
Archive: https://archive.is/0qRmZ

[5] Google Analytics – COVID19-deaths worldwide: https://bit.ly/3fndemJ
Archive: https://archive.is/PpqEE

[6] Laboratory testing for COVID-19 Emergency Response Technical Centre, NIVD under
China CDC March 15th, 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf

[7] Real-Time PCR Handbook Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf

Nolan T, Huggett J, Sanchez E.Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR) First Edition 2013

[8] Trestan Pillonel et al, Letter to the editor: SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

[9] Kurkela, Satu, and David WG Brown. “Molecular-diagnostic techniques.” Medicine 38.10
(2009): 535-540.

[10] Wolfel et al., Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x

[11] Thermofischer Primer Dimer Web Tool: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

Supplementary Material

[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. The
Genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science 300(5624): 1399-1404.

[14] Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete
genome: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947

[15] Borger P. A SARS-like Coronavirus was expected but nothing was done to be prepared. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared
;
Archive: https://archive.is/i76Hu

[16] Eurosurveillance paper evaluation / review process: https://www.eurosurveillance.org/evaluation

[17] Official recommendation of the Corman-Drosten protocol & manuscript by the WHO,published on January 13th 2020 as version 1.0 of the document:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf
; archive: https://bit.ly/3m3jXVH

[18] Official WHO-recommendation for the Corman / Drosten RT-qPCR-protocol, which
directly derives from the Eurosurveillance-publication, document-version 2-1, published on
17th January 2020: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-
1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2

[19] Eurosurveillance Editorial Board, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets/imgs/2020-09-Editorial%20Board%20PDF.pdf
;
Archive: https://bit.ly/2TqXBjX

[20] Instructions For Use LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, January 11th 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gene_V200204_09164154001 (1).pdf

Archive, timestamp – January 11th 2020: https://archive.is/Vulo5;
Archive: https://bit.ly/3fm9bXH

[21] Christian Drosten & Victor Corman, responsible for viral diagnostics at Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Archive: https://archive.is/CDEUG

[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Viral cultures for COVID-
19 infectivity assessment. Systematic review. Systematic review doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

[23] Kim et al.,The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

[24] ECDC reply to Dr. Peter Borger, 18th November 2020:
Supplementary Material

[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & team, survey & Primer-BLAST table:
Supplementary Material

Literatura adicional:

Description RT-PCR RKI Germany, on page 10 of this link:
https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBE
DownloadsJ/JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf?__blob=p
ublicationFile


Filiaciones de los autores:

1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), Molecular Genetics, W+W Research Associate, Lörrach, Germany 
2) Rajesh Kumar Malhotra (Artist Alias: Bobby Rajesh Malhotra), Former 3D Artist / Scientific Visualizations at CeMM – Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences (2019-2020), University for Applied Arts – Department for Digital Arts Vienna, Austria
3) Dr. Michael Yeadon BSs(Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacology U Surrey. Managing Director, Yeadon Consulting Ltd, former Pfizer Chief Scientist, United Kingdom 
4) Dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, United Kingdom
5) Kevin McKernan, BS Emory University, Chief Scientific Officer, founder Medical Genomics, engineered the sequencing pipeline at WIBR/MIT for the Human Genome Project, Invented and developed the SOLiD sequencer, awarded patents related to PCR, DNA Isolation and Sequencing, USA
6) Prof. Dr. Klaus Steger, Department of Urology, Pediatric Urology and Andrology, Molecular Andrology, Biomedical Research Center of the Justus Liebig University, Giessen, Germany
7) Dr. Paul McSheehy (BSc, PhD), Biochemist & Industry Pharmacologist, Loerrach, Germany
8) Dr. Lidiya Angelova, MSc in Biology, PhD in Microbiology, Former researcher at the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, USA
9) Dr. Fabio Franchi, Former Dirigente Medico (M.D) in an Infectious Disease Ward, specialized in "Infectious Diseases" and "Hygiene and Preventive Medicine", Società  Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Italy
10) Dr. med. Thomas Binder, Internist and Cardiologist (FMH), Switzerland
11) Prof. Dr. med. Henrik Ullrich, specialist Diagnostic Radiology, Chief Medical Doctor at the Center for Radiology of Collm Oschatz-Hospital, Germany
12) Prof. Dr. Makoto Ohashi, Professor emeritus, PhD in Microbiology and Immunology, Tokushima University, Japan
13) Dr. Stefano Scoglio, B.Sc. Ph.D., Microbiologist, Nutritionist, Italy
14) Dr. Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), specialist in Laboratory Medicine (clinical chemistry), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, The Netherlands
15) Dr. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD Environmental Chemistry and Toxicology. DGI Consulting Services, Oslo, Norway
16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Department of Radiation Oncology, Leopoldina Hospital Schweinfurt, Germany
17) Dr. Ruth Schruefer, PhD, human genetics/ immunology, Munich, Germany, 
18) Dra. Berber W. Pieksma, General Practitioner, The Netherlands
19) Dr. med. Jan Bonte (GJ), Consultant Neurologist, The Netherlands
20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (Molecular biologist), IP specialist, BDC Basel, Switzerland
21) Dr. Kevin P. Corbett, MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Social Sciences (Science & Technology Studies) London, England, United Kingdom
22) Prof. Dr. Ulrike Kämmerer, specialist in Virology / Immunology / Human Biology / Cell Biology, University Hospital Würzburg, Germany

Contribuciones de los autores:

PB: Planeó y llevó a cabo los análisis e investigaciones, conceptualizando el manuscrito.
BRM: Planeó y llevó a cabo la investigación, conceptualizando las figuras y el manuscrito.
MY: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
KMcK: Condujo los análisis e investigaciones, conceptualizó el manuscrito.
KS: Condujo los análisis y la investigación.
PMcS: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
LA: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
FF: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
TB: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
HU: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
MO: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
SS: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
MDvK: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
DG: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
RJK: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
RS: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones y del manuscrito.
BWK: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
RvV: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
JB: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
KC: Corrección de pruebas de análisis e investigaciones.
UK: Planeó y llevó a cabo los análisis e investigaciones, conceptualizando el manuscrito.

Otros correctores de pruebas:

Saji N Hameed, Environmental Informatics, University of Aizu, Tsuruga, Ikki-machi, Aizuwakamatsu-shi, Fukushima, Japan
Howard R. Steen, MA Chem. Eng. Cantab, Former Research Manager, Germany

2 comentarios:

  1. El insesante debate sobre si hay que dar prioridad a la salud o a la economía es muy parecido a debatir sobre el aborto,la pena de muerte o la independencia de Cataluña:son discusiones que parecen no llevar a ningún sitio.Pero resulta curioso como algo que aprendemos desde niños,eso de que el dinero mueve el mundo,es aún más extremo de lo que ya creíamos.Empresarios de hostelería,comerciantes dependientes del turismo,taxistas,rentacars, feriantes e incluso mimos (estatuas vivas) son muy dados al negacionismo,a señalar esto como,si no una pantomima y un fraude,como algo absurdamente muy exagerado y, además,este grupo de personas que dependen de aeropuertos abiertos y movimiento total del dinero,te suele decir que no conocen a nadie infectado por esta "pandemia".Este grupo es partidario de abrirlo todo ya y que caiga el que tenga que caer.Pero luego están los políticos, funcionarios o gente muy bien asentada en una empresa (como los bancarios) que te sueltan que la salud es lo primerísimo,que esta es la mayor pandemia de todos los tiempos y que,por supuesto,conocen muchísimas personas fallecidas por esta horrible calamidad.Este grupo,con la cartera bien armada,son partidarios de darle total preferencia a la salud y al que vive del turismo que le parta un rayo.Puedo suponer el recochineo que ya habrá habido entre comunidades de vecinos con esto.Una pareja de funcionarios con otra pareja de,por ejemplo,artistas de teatro.Mientras tanto,el terror y la desesperación se apodera de muchos españoles,las agencias de viajes las primeras:Y si el turismo ya no regresara jamás??,al menos,no con la fuerza para vivir tantos de lo mismo.Albe CARACCIOLA.

    ResponderEliminar
  2. Impresionante la investigación realizada. No puede haber un informe científico tan completo y tan estudiado y analizado como éste, referente a las pruebas PCR. Bravo,....bravisimo por los autores de la presente investigación.

    ResponderEliminar